摘  要: 針對(duì)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像分割時(shí)細(xì)胞粘連比較嚴(yán)重的情況,采用了邊界距離變換和模擬浸水原理的分水嶺變換相結(jié)合的方法。首先采用距離變換的方法提取細(xì)胞區(qū)域的局部極小值作為種子點(diǎn)，合并距離過(guò)小的錯(cuò)誤種子點(diǎn)，然后使用分水嶺算法進(jìn)行分割。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠有效地分割斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像,成功地解決了分水嶺變換中粘連細(xì)胞的過(guò)分割問(wèn)題，且計(jì)算速度快。
關(guān)鍵詞: 粘連細(xì)胞; 距離變換; 分水嶺變換

    細(xì)胞計(jì)數(shù)是生物醫(yī)學(xué)檢查的一項(xiàng)重要內(nèi)容，生物體中的細(xì)胞有其生理功能，在不同生理狀態(tài)下，可引起細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量的變化。這種變化是判斷有無(wú)疾病以及疾病種類(lèi)和嚴(yán)重程度的重要依據(jù)。而在實(shí)際細(xì)胞圖像中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞聚在一起的現(xiàn)象，稱(chēng)為細(xì)胞粘連。在計(jì)數(shù)的過(guò)程中，需要把這些粘連的區(qū)域分割成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞。近年來(lái)，針對(duì)分割粘連細(xì)胞的問(wèn)題，研究人員提出了很多分割方法[1-2]。其中， 分水嶺圖像分割方法[3]是一種基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的經(jīng)典算法，它以快速、準(zhǔn)確、有效等特點(diǎn)越來(lái)越受到人們的重視，目前已廣泛應(yīng)用于圖像分割領(lǐng)域。分水嶺圖像分割方法采用的原理主要有模擬浸水過(guò)程[4]和模擬降水過(guò)程[5]兩種。使用分水嶺算法對(duì)圖像進(jìn)行分割，可以產(chǎn)生單像素寬的連續(xù)邊界，但是通常由于噪聲等因素的影響，使得直接使用分水嶺算法對(duì)圖像進(jìn)行分割會(huì)產(chǎn)生過(guò)分割現(xiàn)象。為了避免或抑制過(guò)分割現(xiàn)象，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者提出了很多方法，總結(jié)起來(lái)有兩種：一種是在應(yīng)用分水嶺算法之前進(jìn)行預(yù)處理，抑制噪聲等的影響[6]；另一種是在分水嶺分割后，根據(jù)某種準(zhǔn)則進(jìn)行區(qū)域合并。
    斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像的一個(gè)特點(diǎn)就是細(xì)胞粘連非常嚴(yán)重，這給斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像的分割帶來(lái)了很大的困難。本文在對(duì)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像進(jìn)行分割時(shí)，針對(duì)粘連比較嚴(yán)重的情況，先對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理，然后使用分水嶺方法進(jìn)行分割。
1 斑馬魚(yú)簡(jiǎn)介
    斑馬魚(yú)是一種體長(zhǎng)3~4 cm的熱帶魚(yú)，因其色彩鮮明的斑紋得名。這種小魚(yú)雖然十分常見(jiàn)，卻一直是科學(xué)家關(guān)注的焦點(diǎn)，因?yàn)樗哂凶晕倚迯?fù)破損視網(wǎng)膜的獨(dú)特能力。對(duì)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜能夠自我修復(fù)的能力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其視網(wǎng)膜內(nèi)的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞能夠分化成健康的視網(wǎng)膜細(xì)胞，從而修復(fù)受損的視網(wǎng)膜。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)的視網(wǎng)膜中也擁有類(lèi)似于斑馬魚(yú)能夠修復(fù)視網(wǎng)膜的細(xì)胞。研究人員在老鼠身上進(jìn)行的移植實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功。向患有視網(wǎng)膜疾病的老鼠體內(nèi)移植放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞分化為健康視網(wǎng)膜細(xì)胞，使視網(wǎng)膜功能恢復(fù)。如果這項(xiàng)技術(shù)能夠應(yīng)用于人類(lèi)，將會(huì)使數(shù)以萬(wàn)計(jì)患有眼部疾病的患者重見(jiàn)光明。
   彩色斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像如圖1(a)和圖2(a)所示，其灰度化圖像分別如圖1(b)和圖2(b)所示。
    由圖1和圖2所示的斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像可以看出，圖中有多處粘連的細(xì)胞區(qū)域，特別是圖2中左下部分區(qū)域，有多處多個(gè)細(xì)胞粘連的現(xiàn)象。

2 距離變換
    距離變換在分割一群相互粘連的近圓形物體的情況下比較有用。針對(duì)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像中大塊的粘連細(xì)胞，首先采用距離變換的方法，提取粘連細(xì)胞區(qū)域中各細(xì)胞近似中心點(diǎn)處的信息。
    距離變換是將一幅表示目標(biāo)的二值圖像轉(zhuǎn)化為一幅灰度圖像，這幅灰度圖像中某點(diǎn)的灰度值就是表示原始二值圖像中相應(yīng)坐標(biāo)點(diǎn)關(guān)于最近目標(biāo)的距離。常用的距離度量方法有歐氏距離、城市街區(qū)距離和棋盤(pán)距離。本文使用近似的歐氏距離,在保證運(yùn)算結(jié)果不影響分割效果的前提下,無(wú)需浪費(fèi)大量的時(shí)間和存儲(chǔ)空間來(lái)計(jì)算精確的歐氏距離,因此采用Chamfer 3/4距離變換。
    在進(jìn)行距離變換之前，先對(duì)其灰度化圖像進(jìn)行二值化。要得到某一像素點(diǎn)的全局距離值，需要對(duì)圖像進(jìn)行前后兩次掃描。前向掃描時(shí)，按從上到下、從左到右的順序，取上鄰域的最小值改變當(dāng)前距離值；再反向掃描，按從下到上、從右到左的順序，利用鄰域值進(jìn)行修正，修正后模板中心點(diǎn)的距離值即為該點(diǎn)的全局距離值。在對(duì)圖像進(jìn)行Chamfer 3/4距離變換后，灰度值為0的像素點(diǎn)變換前后距離值不變，而非0像素點(diǎn)距0值像素點(diǎn)的距離越遠(yuǎn)灰度值越大。
    對(duì)距離變換后的圖像進(jìn)行取反運(yùn)算，使背景距離值為最大。這樣在細(xì)胞的近似中心點(diǎn)處出現(xiàn)了局部灰度極小值，且局部灰度極小值點(diǎn)到細(xì)胞邊界各處的距離近似相等，類(lèi)似于圓的圓心。這些局部灰度極小值點(diǎn)對(duì)分割有很重要的作用,需要對(duì)其進(jìn)行提取。
3 種子點(diǎn)獲取及合并
    在經(jīng)過(guò)距離變換后的灰度圖像中，目標(biāo)區(qū)域已經(jīng)出現(xiàn)了局部極小值點(diǎn)，對(duì)這些極小值點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，這些標(biāo)記的局部極小值點(diǎn)稱(chēng)為種子點(diǎn)。在斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像中，由于幾個(gè)細(xì)胞互相粘連，會(huì)導(dǎo)致在一個(gè)細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部出現(xiàn)多個(gè)種子點(diǎn)，而每個(gè)種子點(diǎn)在分割時(shí)都代表一個(gè)細(xì)胞，這樣一個(gè)細(xì)胞就會(huì)被分割成多個(gè)區(qū)域，從而導(dǎo)致過(guò)分割。為了正確地分割這些粘連的細(xì)胞，需要合并種子點(diǎn)，刪除錯(cuò)誤的不應(yīng)出現(xiàn)的種子點(diǎn)。
    本文根據(jù)種子點(diǎn)之間的距離值進(jìn)行合并。計(jì)算兩個(gè)種子點(diǎn)之間的距離，并統(tǒng)計(jì)最大和最小距離值，求出平均距離。根據(jù)平均距離，設(shè)閾值對(duì)種子點(diǎn)進(jìn)行合并，刪除距離過(guò)小的種子。根據(jù)計(jì)算的距離值獲取種子點(diǎn)的具體方法如下。
    (1)遍歷距離圖像,獲取5×5鄰域的極小值,并設(shè)bMin=true；
    (2)獲取極小值點(diǎn)的上鄰域標(biāo)記label。判斷掃描過(guò)的點(diǎn)是否有標(biāo)記，如果標(biāo)記過(guò)（label!=0），賦為相同標(biāo)記值；否則標(biāo)記值+1，再賦為標(biāo)記；
    (3)將其5×5鄰域像素點(diǎn)都賦予該種子標(biāo)記值作為種子區(qū)域，并統(tǒng)計(jì)種子中心點(diǎn)的位置；
   (4)刪除兩個(gè)距離過(guò)小的種子。設(shè)定閾值threshold，計(jì)算任意兩個(gè)種子中心點(diǎn)之間的距離dis。若dis≤threshold，則將前一個(gè)種子標(biāo)記刪除，后續(xù)各標(biāo)記值都相應(yīng)減1。
    圖1和圖2所示的兩幅斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜圖像的種子圖像如圖3所示。種子點(diǎn)是按從小到大的順序進(jìn)行標(biāo)記的，值為1，2，3，...。

4 分水嶺變換
    基于模擬浸水的分水嶺變換過(guò)程中，水從盆地中慢慢上漲，當(dāng)處在不同盆地中的水快要相交時(shí)，在相交處修建水壩（分水線）進(jìn)行阻隔，最后得到一個(gè)個(gè)水壩和被淹沒(méi)的各個(gè)盆地，從而達(dá)到分割的目的。在對(duì)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像經(jīng)過(guò)以上預(yù)處理的基礎(chǔ)上，對(duì)得到的種子圖像使用分水嶺方法進(jìn)行分割,具體算法如下：
    (1)統(tǒng)計(jì)直方圖,獲取初始水位minVal,水位上升Val++；
　 (2)掃描圖像，獲取圖像中未被標(biāo)記且小于水位的像素點(diǎn)；
　 (3)判斷種子附近點(diǎn)像素，若附近有單一的種子點(diǎn)，則置為標(biāo)記；若有多個(gè)種子點(diǎn)（有標(biāo)記但和當(dāng)前標(biāo)記值不同），則置為分水嶺，bEdge=true，并設(shè)bover==false；
    (4)若bover==false，轉(zhuǎn)到步驟(2)重復(fù)生長(zhǎng)，直至水位不再上升為止bover==true。
     以上所論述方法已通過(guò)Visual Studio 2008編程實(shí)現(xiàn)。對(duì)圖3所示的兩幅斑馬魚(yú)種子圖像使用分水嶺變換，得到的分割結(jié)果如圖4所示，分割出的每個(gè)區(qū)域都用不同的顏色表示以示區(qū)分。從兩幅結(jié)果圖可以看出，在有多個(gè)細(xì)胞粘連的區(qū)域處用深色分水線分割開(kāi)了，分水線兩側(cè)的區(qū)域分屬于兩個(gè)不同的細(xì)胞。

    通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像的分割研究發(fā)現(xiàn)，在處理輪廓模糊、邊界不清的粘連細(xì)胞圖像時(shí)，使用距離變換的方法可獲取區(qū)域局部極小值，分離出粘連在一起的區(qū)域；再合并相近的種子點(diǎn)，可以減少過(guò)分割現(xiàn)象；最后使用分水嶺分割算法，較好地解決了粘連細(xì)胞區(qū)域的分割問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)證明，本文提出的方法能有效地分割斑馬魚(yú)視網(wǎng)膜細(xì)胞圖像，但仍存在一定的欠分割現(xiàn)象。
參考文獻(xiàn)
[1] 潘晨,閆相國(guó),鄭崇勛.一種分割重疊粘連細(xì)胞圖像的改進(jìn)算法[J]. 中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2006，25(4):390-395.
[2] 林小竹,王彥敏,杜天蒼.基于分水嶺變換的目標(biāo)圖像的分割與計(jì)數(shù)方法[J]. 計(jì)算機(jī)工程,2006,32(15):181-183.
[3] GONZALEZ R C, WOODS R E. Digital image processing(2nd Ed.)[M].Beijing: Publishing House of Electronics Industry, 2007.
[4] VINCENG L, SOILLE P. Watershed in digital spaces: an efficient algorithm based immersion simulations[J]. IEEE  Transactions on PAMI, 1991,13(6):538-598.
[5] 袁曉輝,許東,夏良正,等.基于形態(tài)學(xué)濾波和分水線算法的目標(biāo)圖像分割[J].數(shù)據(jù)采集與處理, 2003,18(4):455-459.
[6] 王宇,陳殿仁,沈美麗,等.基于形態(tài)學(xué)梯度重構(gòu)和標(biāo)記提取的分水嶺圖像分割[J].中國(guó)圖象圖形學(xué)報(bào)，2008，13(11):2176-2180.