0 引言

　　免疫熒光分析技術是新發展起來的精密的免疫標記檢測技術，與傳統的酶聯免疫法及金標法相比，免疫熒光分析技術靈敏度高，特異性強，操作方便，不用放射性物質作為標記物，因此具有無放射性、標記物穩定、便于長期保存、試驗重復性好、分析速度快、樣品用量少及標準曲線量程寬等優點[1]。熒光分析法是測定物質吸收了一定頻率的光以后，物質本身所發射的光的強度。熒光的強度與物質數量之間存在正比關系，可通過測定熒光的光譜和熒光強度，對物質進行定性或定量的分析。免疫熒光分析技術是目前生物醫學檢驗中常用的快速分析技術，在微生物、病毒抗原或抗體檢測、激素檢測、腫瘤標志物檢測、毒品海洛因、嗎啡、搖頭丸、氯胺酮等檢測領域具有廣闊的應用前景。

1 免疫熒光定量檢測原理

　　將特異的熒光抗體先固體于硝酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的硝酸纖維素一端滴加樣品后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該熒光體發生特異性結合，隨著進一步的層析作用，用此抗原的另一個抗體對此復合物進行捕捉，多余的熒光抗體用其二抗進行捕捉，兩次捕捉的位置分別稱為質控線（C線）和檢測線（T線）。當光源照射到檢測卡上時，質控線和檢測線分別激發出不同強度的熒光，光電轉換器接收不同強度的熒光產生不同大小的電信號，電信號的強弱反映出待檢測物的濃度，從而實現特異性的免疫診斷。

2 免疫熒光定量分析儀系統設計

　　免疫熒光定量分析儀主要由光學部分、硬件電路部分以及系統軟件部分組成。光學部分是熒光定量分析儀的核心部分，用來激發出熒光，而硬件電路部分和系統軟件部分則用來進行熒光信號的檢測處理以及控制整個儀器的正常運行。

　　2.1 光學部分設計

　　光學部分設計如圖1所示，光學部分由光源發射光路和熒光檢測光路兩部分組成。

　　光源發射光路由LED光源、凸透鏡1、濾光片1和凸透鏡2組成。LED光源的光軸與凸透鏡1、濾光片1以及凸透鏡2的光軸在一條線上。光源為綠色(中心波長為580 nm)高亮度LED光源，LED位于發射光路凸透鏡1的焦點，這樣光源發出的光經凸透鏡1后變為平行光，濾光片1采用中心波長580 nm帶寬為30 nm的窄帶干涉濾光片，平行光經過濾光片1后，入射光中565 nm～595 nm范圍以外的光被濾除掉，出射的光為窄帶光(565 nm～595 nm)，其經過凸透鏡2后，被聚焦到樣品上，激發出熒光，熒光波長為610 nm。

　　熒光檢測光路由凸透鏡3、濾光片2、凸透鏡4和光電轉換器組成。光電轉換器與凸透鏡3、濾光片2、凸透鏡4的光軸在一條線上。熒光檢測光路光軸和發射光路光軸成45°角，最大程度地減少了激發光對熒光信號檢測的影響。熒光檢測光路光軸和發射光路光軸的交點在檢測試紙上，且交點為凸透鏡2和凸透鏡3的焦點。濾光片2采用中心波長610 nm，帶寬為15 nm的窄帶干涉濾光片。激發出的熒光被凸透鏡3收集后變為平行光，平行光通過濾光片2后，原來的少量激發光會被濾光片濾除掉，僅剩激發出的610 nm左右的熒光信號通過[2-3]。通過濾光片后的光被凸透鏡4收集聚焦到熒光檢測模塊上的光電轉換器上，實現光信號到電信號的轉換。

　　2.2 系統硬件電路部分設計

　　系統硬件電路的結構框圖如圖2所示，儀器的測量原理是：處理器控制步進電機帶動待檢測樣本到達檢測器的檢測口上方，通過發光控制模塊控制LED的發光強度以符合測量的強度要求，光電傳感器檢測熒光信號的強弱，傳感器輸出信號經放大和濾波處理后進入ADS1252轉化為數字信號交給處理器進行處理[4]。

　　圖2中檢測器框中所示的部分包括上文2.1所描述的光學部分以及部分硬件電路，兩部分共同封裝在檢測器內，提高了檢測信號的穩定性和抗干擾能力。檢測器硬件電路部分由發光控制模塊和熒光檢測模塊組成。

　　為了保證光源的穩定性，發光控制模塊采用了恒流源驅動方式，這樣可以有效保證光源發光強度的恒定。對于有的樣品，照射光源不宜太強，因此，恒流源采用的是程控調節的恒流源，通過輸入不同的數字值，可以控制LED的發光強度。即LED驅動電流的大小可以通過程序進行控制。

　　光電轉換器選用內置運放的光電轉換芯片OPT101。熒光檢測模塊包含了光電轉換、信號放大濾波、電壓偏置、模/數轉換等部分。其中，信號放大采用程控放大，模/數轉換采用24位的A/D轉換芯片ADS1252，可保證足夠的轉換精度和大的動態檢測范圍。檢測器傳輸給控制器的是數字電信號，數字信號比模擬信號有更強的抗干擾能力和準確性，這就大大提高了系統的檢測精度。

　　2.3 系統軟件部分設計

　　系統軟件使用C語言進行編寫，軟件流程圖如圖3所示。系統初始化主要完成系統各外圍模塊的配置以及歷史設置的讀取和配置。待系統初始化完成后，控制電機帶動樣品卡卡槽出倉，并在顯示屏上提示用戶插入檢測樣品卡。系統循環檢測樣品卡是否插入卡槽內，當檢測到樣品卡插入后系統打開二維碼掃描槍并控制電機帶動樣品卡移動至掃描槍處進行二維碼的讀取。二維碼包含檢測項目、產品批號、標準曲線等信息。系統判斷二維碼信息有效后打開LED并根據二維碼相關信息調整LED亮度同時控制電機帶動待檢測樣本移動至檢測器上方進行檢測。采集到的數據將以txt文件的形式保存在SD卡內，經一定的算法計算出T線與C線對應波峰的面積比后代入二維碼信息中的標準曲線內，得出待檢測樣品的濃度并將最終的熒光強度曲線及樣品的濃度檢測結果顯示到顯示屏上并自動存儲和打印檢測信息[5]。

3 測試結果及分析

　　本文設計的免疫熒光定量分析儀可以測量血液和尿液中多種物質的濃度，本文以NT-proBNP（N末端腦鈉肽前體）的濃度測量為例對儀器的運行效果進行分析。NT-proBNP是由心臟分泌的一種神經內分泌激素 ，已被證明是臨床上診斷、治療及判斷心力衰竭患者預后的重要指標[6]。

　　3.1 熒光信號的采集

　　將樣品卡插到儀器的卡槽內進行檢測得到熒光強度曲線如圖4所示。圖中橫坐標代表數據個數，縱坐標代表光電轉換器輸出的電壓值，單位為mV。

　　3.2 標準直線擬合

　　得到樣品熒光強度的曲線后，利用高斯擬合可以計算出T線和C線對應的曲線波峰的面積，利用T線和C線對應波峰的面積可以計算出待檢測樣品的濃度。這就需要一組標準濃度校驗品，根據標準濃度校驗品的測量結果，建立一定的數學模型計算出T線和C線對應波峰的面積與樣品濃度之間的數學關系。

　　根據標準濃度校驗品得到樣品濃度與T線對應波峰的面積（用AT表示）與C線對應波峰的面積（用AC表示）之比AT/AC的對應關系如表1所示。

　　由表1中的對應關系，利用最小二乘法得到的樣品濃度與AT/AC數學量化關系，如圖5所示。

　　由圖5可以得出，最小二乘法擬合直線的表達式如式1所示：

　　y=9 912.156x-84.742 8(1)

　　直線擬合相關系數R=0.999 92，說明這6種標準濃度校驗品的濃度與AT/AC之間存在良好的線性關系。

　　3.3 系統測量誤差分析

　　選擇一組同一批次不同濃度標準濃度樣品，依據式1對樣品濃度進行測量，分析系統的檢測誤差，得到的測量結果如表2所示。

　　由表2的實測結果可以看出，對于標準濃度樣品的測量誤差在±8%以內，滿足實際的使用要求。下面選取一組醫院的病人血液樣品，以進口的銳普智能熒光干式定量分析儀作為標準儀器進行對比測量。每個病例取75 L病人血液樣本加到樣品緩沖液中，將溶液充分混勻后取75 ?滋L混勻后的樣本滴加到樣品卡的加樣孔內，等待15 min后將樣品卡插入到儀器的卡槽內得到的測量結果如表3所示。

　　由表3的對比測量結果可以看出，本文設計的免疫熒光定量分析儀與現已商品化的免疫熒光檢測儀相比，測量誤差在±8%以內，能滿足臨床應用要求。

4 結論

　　本文設計了免疫熒光定量分析儀，對儀器的光學部分、硬件電路部分以及系統軟件部分進行了詳細介紹。從多個角度對儀器的運行結果進行了分析，從測試結果可以看出，儀器可以擬合出線性度良好的標準直線，通過對標準校驗品的測量試驗和與標準儀器的對比試驗表明儀器在小型化、快速性的基礎上，測量誤差能夠控制在±8%以內，可以滿足臨床應用的要求。

參考文獻

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　　[3] 張可可，閆星魁，陳世哲.熒光法海水葉綠素a傳感器設計[J].山東科學，2013，26(3)：37-40.

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